Nature：CRISPR技术又添潜在新功能-医荟园

我们都知道CRISPR-Cas系统能用于基因编辑。而最近，加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna教授团队发现，这个系统还能用于检测痕量RNA。

CRISPR-Cas是细菌中演化出的一套适应性免疫系统，用于清除外源的病毒或质粒核酸。根据组分的不同，CRISPR-Cas被分为I、II、III、IV等类型。我们现在常常听到的用于DNA定向改造的CRISPR-Cas9属于其中的II型。除此之外，近来发现的IV型CRISPR-Cas系统则是在特定RNA指导下对RNA进行切割降解，其中单亚基的C2c2蛋白充当着切割RNA的核酸酶角色。

然而，C2c2功能的实现并不是自发的，需要在指导C2c2上述核酸酶活性的特定crRNA影响下才能发挥出来。我们现在已知，crRNA的前体转录自细菌基因组中呈簇状分布的前间区序列（protospacer），即所谓的“CRISPR阵列”（CRISPR array）。其中，单个前间区序列为较短（20bp左右）的与外源靶向序列互补的DNA片段，它们之间由重复出现的短回文序列所分隔。CRISPR阵列会最初被整体转录形成前体crRNA（pre-crRNA），后者将被特定的核酸酶剪接，使得各个不同的前间区序列相互分来，成为成熟的crRNA片段。就这样，成熟crRNA片段上有专门通过互补识别目标DNA或RNA的配对片段，以及由前间区序列间重复片段转录而来、供Cas酶识别的片段，后者中因含有短回文序列而形成茎环结构。

▲crRNA形成过程示意图（图片来源：《Nature》）

那么，将前体crRNA剪接成为成熟crRNA片段的核酸酶究竟是何种物质呢？在I、II、III系统中，它们或者为系统自带的Cas酶，或者为与反式激活crRNA共同完成切割的宿主核酸内切酶。然而，对于IV型CRISPR-Cas系统来说，这一crRNA成熟所需核酸内切酶的身份至今未知。

最近，加州大学伯克利分校Jennifer A. Doudna教授揭开了这一谜底，这一crRNA成熟所需核酸酶正是C2c2。他们还发现，C2c2有着独特的双重RNA酶功能，不仅介导crRNA的成熟过程，还是IV型CRISPR-Cas系统的效应酶，用于最终降解外源RNA。这一成果发表于近期的《Nature》期刊上，并为当下火热的CRISPR-Cas技术系统再添新的应用场景。

▲Jennifer A. Doudna教授（图片来源：Berkeley官网）

研究者们证实，在C2c2中，完成不同RNA酶功能的区域也是相互独立的，几乎互不影响。此外，两种功能所采取的机理也有着明显不同。相比于降解外源RNA底物，C2c2在crRNA成熟过程中的功能行使无需二价金属离子的参与，而此时的RNA酶活性则要比最终降解底物时低约80倍。

在crRNA成熟过程中，C2c2主要通过crRNA上的茎环结构对其进行具有高度特异性的识别。一旦茎环的长度被人为改变或者序列被颠倒，C2c2剪接前体crRNA的比例和效率都会明显降低。如果直接将前体crRNA上的C2c2剪接位点（茎环结构序列上游第五个核苷酸位点处）附近的连续四个位点突变后，C2c2便几乎完全失去了剪接能力。

▲crRNA和C2c2产生及工作机制（图片来源：《Nature》）

当crRNA成熟后，C2c2的底物降解活性可被识别到互补外源RNA片段的crRNA激活，进而对细胞中所有的RNA不加区别地一并降解。这一过程进行地十分高效和彻底，连像tRNA这种大型分子都不放过。举个例子，当C2c2与可识别噬菌体γ的crRNA同时被转染进入Hela细胞后，仅仅需提供1-10pM浓度的外源噬菌体γRNA便可在30分钟内产生十分明显的核酸降解信号（RNAse-Alert的荧光强度上升了25-50%！），而这还是仅有约0.02%的C2c2-crRNA复合物处于活性状态下的效果。研究者估计，在每个crRNA识别到目标外源序列后，C2c2可至少连续降解一万条RNA分子。因此，这种有着如此高活性的C2c2无疑为RNA检测提供了一条可能比PCR等更高效、高灵敏度的途径，这将在对痕量RNA的检测上显得尤其重要。

研究者指出，细菌的这种适应性免疫方式类似于真核生物中的RNase L和caspase系统，后者可在特定信号刺激下，对细胞内的所有RNA和蛋白质进行不加区别的降解，引起细胞凋亡，从而彻底清除病毒等有害物质。对于细菌而言，C2c2则可能起到一个“哨兵”的作用，一旦通过crRNA发现入侵的病毒RNA，便激发其RNA降解活性，连同病毒RNA一起立即清除细胞内所有的RNA。

“这一研究扩展了我们对于C2c2 RNA剪接功能的认识，为这一新发现的RNA酶提供了第一个可能的应用场景，”论文的通讯作者Jennifer A. Doudna教授说道：“C2c2就像一个把自己武装起来的哨兵，一旦发现目标RNA后，便会把细胞里所有的RNA降解。这一性质可被开发为具有自我放大功能的检测方法，也许可成为一种廉价而高效的诊断手段。”

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